OPTIMIZACIÓN DE UNA TÉCNICA PARA AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO DE ESPERMATOZOIDES DE TORO

Autores/as

  • Martha Vázquez Aguirre
  • Javier de Jesús Valencia Méndez
  • Manuel Barrientos Morales
  • Noé Orlando Juárez López
  • Alejandro Córdova Izquierdo
  • Juan Manuel Pinos Rodríguez
  • María de Lourdes Juárez Mosqueda

DOI:

https://doi.org/10.47163/agrociencia.v54i8.2302

Palabras clave:

PCR, aislamiento de ADN, Bos taurus, espermatozoides.

Resumen

Los espermatozoides de toro exhiben estructuras específicas que protegen su ADN y, por lo tanto, las técnicas estándar utilizadas para el aislamiento del ADN somático no son eficientes. Así pues, nuestro objetivo fue diseñar un aislamiento del ADN de espermatozoides de toro que fuera económico, rápido y eficiente, con la hipótesis de que la combinación adecuada de agentes químicos y un conjunto de alternativas nos permitirían diseñar un método mejorado para extraer el ADN de los espermatozoides de toro para su utilización en los ensayos de PCR. Una serie de réplicas obtenidas de cinco eyaculados se utilizó para evaluar seis métodos de extracción de ADN de espermatozoides de toro: 1) el método convencional que utiliza la proteinasa K y el fenol-cloroformo; 2) el método de papaína, DTT, DMSO, CTAB y SDS (para solubilizar la teca perinuclear y reemplazar el fenol-cloroformo); 3) el método del detergente no iónico Brij 36-T para eliminar la membrana plasmática; 4) el método del DTT y la heparina para la descondensación de la cromatina nuclear; 5) el método SDS y; 6) el método CTAB para eliminar la membrana plasmática. Las muestras de ADN se analizaron espectrofotométricamente para determinar la concentración y la pureza del ADN, y luego se utilizaron en cinco cantidades (200, 100, 50, 25 y 12.5 ng) para los análisis de PCR. Para evaluar la repetibilidad del método, se realizaron réplicas del procedimiento más eficiente. Los resultados mostraron que el mejor método para la extracción de ADN de espermatozoides de toro fue el sexto, basado en el uso del CTAB como agente de remoción de membranas; papaína, DTT y DMSO como tampón de lisis y DTT, heparina y SDS como solución de descondensación, y se logró una concentración que oscilaba entre 63 y 154 ng µL-1 y una calidad óptima (A260/A280= 1.75 y 1.73) en la extracción de semen fresco y congelado, respectivamente. En conclusión, considerando las características estructurales del espermatozoide, diseñamos un método simple y eficiente para extraer el ADN de los espermatozoides de toro sin limitaciones en la PCR. Además, todo el procedimiento puede realizarse en un período corto de tiempo, sin necesidad de emplear el tratamiento con fenol-cloroformo y proteinasa K.

Publicado

2020-12-23 — Actualizado el 2020-12-29

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